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　　未知化合物的鑒定極大地受益于高分辨率（HiRes）質譜系統不斷提高的質量準確度能力。不幸的是，由于各種硬件 / 固件 / 軟件因素，除了有限的情況外，唯一確定完全未知物元素組成的 “圣杯” 仍然難以實現。

　　雖然已知高分辨率質譜能夠輕松實現 1-5ppm 甚至更好的質量準確度測量，但這些儀器缺乏譜圖準確度（Spectral Accuracy，SA），而譜圖準確度有助于進一步排除不正確的元素組成。矛盾的是，低或較低分辨率（LowRes）質譜雖然通常具有較低的可實現質量準確度，但卻具有較高的譜圖準確度。

　　在本文中，我們展示了在一次分析中利用高分辨率和低分辨率測量的可行性，通過利用現有 Orbitrap LC/MS 系統上可用的高分辨率和低分辨率掃描能力，在同一次進樣和數據采集中實現獨特且高置信度的元素組成測定！

方法

　　1. 實驗儀器及材料

　　LC/MS儀器：賽默飛 Orbitrap Exploris 480 和 Vanquish UPLC，

　　色譜柱： ThermoFisher Accucore C18（2.6 μm，100×2.1 mm）

　　樣品：Restek 31977（LC 多殘留農藥標準品 #6，有機氮化合物，100 μg/mL，乙腈），稀釋至 500 ppb。

　　軟件：Xcalibur 軟件（賽默飛）、MassWorks 軟件（Cerno Bioscience）

　　2. 實驗條件

　　色譜柱：流速 0.3 mL/min，溫度 40°C。

　　流動相 A：水 + 0.1% 甲酸，流動相 B：乙腈 + 0.1% 甲酸。梯度洗脫（B 相）：0-1 分鐘 1%，1-5 分鐘 25%，5-15 分鐘 60%，15.1-19 分鐘 90%，19.1-20 分鐘 1%。

　　質譜數據采集：ESI+模式

　　全掃描質譜，高分辨率 120K 分辨力（RP），自動增益控制（AGC）目標 1e6，50-500 Da ；

　　數據依賴型（DDA）全掃描 MS2：10 個離子，15K 分辨力，0.50Da 窗口，AGC 目標 1e5 ；

　　全掃描質譜，低分辨率 15K 分辨力，AGC 目標 1e6，50-500 Da。

　　使用賽默飛 Xcalibur 軟件進行后處理，使用 Cerno MassWorks 軟件進行 sCLIPS（自校準線形同位素輪廓搜索）譜圖準確度分析。

結果與討論

　　使用 Xcalibur 軟件和精確質量提取離子色譜圖（XIC），在采集的運行數據中確認了 28 種預期化合物中的 26 種，其預期保留時間（RT）位置已確定，如表1總結及其他分析結果所示。

表1：28種化合物的分析結果

　　120K 和 15K 分辨率下的質量誤差和標準偏差

　　在每個確定的保留時間窗口內，使用 120K 和 15K 分辨力下最多 3 個最豐富的全掃描質譜來報告每個分辨力下的精確單同位素質量值，將每個平均精確質量與理論精確質量進行比較，計算質量誤差（偏差）以及每個分辨力下的相應標準偏差，如圖1和圖2所示。

圖1：在 120K 分辨力下的質量誤差和標準偏差

　　在 120K 分辨力下，所有質量誤差均為正值且 < 0.6 mDa（除了錯誤識別的化合物 #13），而標準偏差小 2-3 倍或 < 0.2mDa，這表明在 120K 分辨力下系統質量誤差占主導地位，除非不可能，否則進一步改進的可能性不大。盡管如此，這使得在狹窄的 1mDa 質量窗口內搜索未知元素組成成為可能，但僅憑這一點甚至不足以接近唯一鑒定，26 種檢測到的化合物的候選分子式的平均個數為 86。

圖2：在15K 分辨力下的質量誤差和標準偏差

　　在 15K 分辨力下，質量誤差和標準偏差均增加，并且由于標準偏差較大，現在出現了負質量誤差。在 15K 分辨力下，使用狹窄的 1mDa 質量窗口進行可靠的未知元素組成搜索是不可行的。幸運的是，有更準確的 120K 分辨力質量測量可用，可以取而代之。

　　120K 和 15K 分辨率下的譜圖準確度

　　如表1的所示的結果中，120K分辨率下產生的同位素譜圖準確度要明顯差于15K分辨率的譜圖準確度，因此導致了在鑒定一些化合物的分子式時的排序不佳，如化合物2，120K分辨率的譜圖準確度為96.3%，分子式在940個后選中排第三，而15K分辨率的譜圖準確度提升至98.4%，分子式排序也提升至第一位。

　　譜圖準確度對正確分子式的鑒定能力

　　為了將這些測試化學品視為真正的未知有機化合物，設計了一個寬松的元素組成搜索條件，包括所有合理預期的元素，并使用關于每種元素可能的原子數及其比例的最廣泛經驗規則，如2表所示。

表2：sClPS檢索條件圖片

　　在MassWorks軟件的sCLIPS檢索分析結果中，對于每種檢測到的化合物，從 120K 和 15K 分辨力中選擇最豐富的掃描用于 sCLIPS 元素組成測定。對于 120K 掃描，使用其自身的精確質量，而對于15K 掃描，采用 120K 掃描的精確質量來搜索所有可能的元素組成，并按譜圖準確度從高到低對列表進行排序。

　　如圖3所示，化合物22號的精確質量值m/z 284.0719采用120K分辨率質譜圖測定，同位素的譜圖準確度98.5%由15K分辨率的質譜圖測定，根據譜圖準確度，正確的分子式在全部的82個候選結果中排名第一。

圖3：化合物22的精確質量測定（120K）和譜圖準確度測定（15K）結果

　　如表1所示，正確化合物的譜圖準確度、其在所有候選分子式中的排名以及與下一個最佳譜圖準確度命中的譜圖準確度差值（SA breakout）均總結在表中。當正確化合物不是最高命中時，SA breakout 計算為正確化合物與最高命中化合物的譜圖準確度差值（負值）。對于所有化合物，從 120K 到 15K 分辨力掃描，譜圖準確度本身（中位數 97.4% vs 98.9%）和 / 或 SA breakout（中位數 0.4% vs 1.6%）均顯著增加，從而在提高排名的同時增加了鑒定置信度。1.0% 的SA breakout 通常意味著唯一鑒定和模糊鑒定之間的區別，因此非常重要。

圖4：化合物14在120K和15K分辨率下的譜圖準確度對比及分子式排名對比

　　以此為基準，在之前的嘗試中，我們使用相同的非靶向方法進行數據采集，并使用 GNPS 分析了一組類似的化合物，其僅正確鑒定了 75% 的測試化合物。

結論

　　如先前發表的文獻（參考文獻2）所述，即使優于 1mDa 的質量準確度也遠遠不足以確定真實未知物的元素組成，在此次測試的 26 種檢測化合物中，平均的候選分子式個數為 86。

　　譜圖準確度（SA）可以在質量準確度之外顯著改善元素組成，在 120K 分辨力（RP）下，26 種化合物中有 23 種在最高 SA 命中中被發現，這與僅使用質量準確度相比是一項壯舉。

　　通過使用 120K 和 15K 分辨力掃描獲得了最顯著的結果，其中所有 26 種化合物的分子式全部被排序在候選結果中的第一位，而且由于 SA 和 SA breakout 的增加，置信度顯著提高，在商用質譜儀上，在相同的一般數據采集條件下，通過單次進樣 LC/MS 分析，在色譜時間尺度上實現了真實未知物的獨特元素組成測定。

　　參考文獻：

　　1.Wang, Y et al, Anal. Chem., 2010, 82, 7055-7062(17)

　　2. Erve,J.etal,JAMSocMassSpectrom., 2009, 20,2058-2069

　　3. Khodjaniyazova, S. et al, Anal. Chem. 2018, 90, 1897?1906

　　4. Strife, R. et al, J Mass Spectrom., 2018, 53, 921–926

　　5. Kind, T. et al, BMC Bioinformatics, 2007, 8:105